BADANIE W KIERUNKU BSE
     testem PRIONICS-CHECK

Podstawy stosowania, walidacja testu
Fragment artykułu który ukazał się w Medycynie Weterynaryjnej 56 (4), 2000, s. 211-213: “Najnowsze informacje nt. laboratoryjnej diagnostyki gąbczastych encefalopatii (transmissible spongiform encephalopaties - TSE)”. Mirosław P. Polak, Jan F. Żmudziński:
"“W dniu 8 lipca br, Komisja Europejska - XXIV Dyrektoriat Generalny (DG XXIV), Wydział Polityki Wobec Konsumenta i Ochrony Zdrowia Konsumenta - udostępniła w sieci Internet raport pt. "Ocena testów diagnostycznych do rozpoznawania gąbczastej encefalopatii u bydła".
Parlament Europejski uznał, że dostępność dobrego testu diagnostycznego stanowi zasadniczy krok na przód w dziedzinie  zwalczania gąbczastej encefalopatii bydła (z ang. bovine spongiform encephalopathy - BSE)  i gąbczastych encefalopatii w ogóle (TSEs).
 Celem badań była ocena wartości diagnostycznej  testów do wykrywania TSE u bydła już dostępnych oraz będących w końcowej fazie przygotowania do wprowadzenia na rynek. Badania zostały zaprojektowane i były kierowane przez DG XXIV Komisji Europejskiej - Wydział Polityki Wobec Konsumenta i Ochrony Zdrowia Konsumenta we współpracy z grupą ekspertów oraz Instytutem Materiałów Referencyjnych i Miar (IRMM), gdzie przygotowywano i kodowano próbki do badania.
Wybór zestawów diagnostycznych:
 19 maja 1998 r. opublikowano w Official Journal of the European Coommission komunikat skierowany do firm pracujących nad zestawami diagnostycznymi do rozpoznawania gąbczastych encefalopatii. Trzydziestu potencjalnych uczestników poprosiło o szczegółowe informacje nt. warunków oceny. Chęć uczestnictwa w ocenie zgłosiło 9 firm, które przedstawiły do oceny 10 zestawów diagnostycznych. Selekcji otrzymanych zgłoszeń dokonał zespół ekspertów: prof. J. Almond i prof. G. Hunsmann oraz dr M. Groschup i dr E. Sprengers kierując się następującymi kryteriami: 1. podstawy naukowe testu, 2. dostępne wyniki dotychczasowych badań eksperymentalnych, 3. łatwość przygotowania materiału do badań i wykonania testu, 4. stopień  zaawansowania prac nad komercjalizacją zestawu. Dla zabezpieczenia szerokiej dostępności testów po uzyskaniu pozytywnego wyniku oceny firmy zgłaszające się do oceny musiały podpisać stosowne zobowiązanie. Wybrano cztery zestawy diagnostyczne następujących firm:
1. E.G.& G. Wallac Ltd. z Wielkiej Brytanii,
2. Prionics A.G. ze Szwajcarii,
3. Enfer Technology Ltd. z Irlandii,
4. Commissariat a l.'Energie Atomique (CEA) z Francji.
 Charakterystyka poszczególnych zestawów diagnostycznych:
Test A: E.G.&G. Wallac Ltd. Test ten wykorzystuje dwa przeciwciała monoklonalne (MoAb), a wykrycie PrP odbywa się metodą DELFIA (fluorescencja pod wpływem lantanowców). Badanie trwa niecałe 24 godziny ale może być skrócone przez wprowadzenie automatyzacji.
Test B: Prionics A.G. Do wykrywania fragmentu białka PrP opornego na proteinazę, określanego też jako PrP 27-30, wykorzystywane jest MoAb 6H4, a detekcja odbywa się metodą chemiluminescencji. Badanie trwa 7-8 godzin. Proces rejestracji próbek wykorzystuje kod paskowy, co pozwala na wprowadzanie danych do bazy danych. Umożliwia to łatwe śledzenie poszczególnych zwierząt. System ten określany jako Prionics Check używany jest w Szwajcarii do rutynowego badania bydła ubijanego w rzeĽniach jak również do badania zwierząt padłych.
Test C: Enfer Technology Ltd. Zestaw ten wykorzystuje test ELISA z użyciem chemiluminescencji. Czas badania wynosi do 4 godzin. Zastosowano przeciwciała poliklonalne dla PrP oraz unikalną procedurę szybkiej ekstrakcji próbki połączoną z techniką ELISA. Jako pierwsze stosowane są przeciwciała poliklonalne dla PrP, następnie koniugat znakowany peroksydazą chrzanową oraz odczynnik chemiluminescencyjny wzmacniający sygnał reakcji.
Test D: Commissariat a l.'Energie Atomique (CEA). Jest to test immunoenzymatyczny typu "sandwich" wykorzystujący dwa MoAb. Wykonanie testu trwa mniej niż 24 godziny i także może zostać skrócone w wyniku automatyzacji.
Wyniki:
(...) Analiza powtarzalności wyników wskazuje, że testy B, C i D poprawnie identyfikowały próbki zduplikowane. Wysoka czułość tych testów wskazuje na ich przydatność do pośmiertnych badań przesiewowych w rzeĽniach. Testy A i B są testami jakościowymi dającymi wynik albo dodatni albo ujemny. Wyniki oceny testów C i D wskazują, że wartości odcięcia (progowe) ustalone przez obie firmy zbliżone są do wartości optymalnych. Jednakże w przypadku tych testów kilka próbek wypadło wątpliwie, gdyż odczyt wyniku układał się w pobliżu wartości odcięcia. Testy C i D badają tę samą próbkę dwukrotnie (w powtórzeniu), natomiast test A trzykrotnie. Test A (E.G.&G. Wallac) wykorzystywał próbkę o masie 100 mg, co, jak skomentował sam producent, było raczej ilością niewystarczającą. Efektem było obniżenie czułości testu i uzyskiwanie wyników fałszywie ujemnych. Firma zaproponowała 5-krotny wzrost masy próbki. Test B (Prionics A.G.) - ponieważ informacje wpisywane są do bazy danych, łatwo jest śledzić wyniki testu w stosunku do miejsca pochodzenia zwierząt. Prionics wykonuje około 200 testów dziennie w ramach regularnego monitorowania BSE dla służby weterynaryjnej Szwajcarii. Wszystkie nierozcieńczone próbki badanych homogenatów zostały zidentyfikowane prawidłowo, ale natężenie sygnału reakcji dodatniej było różne dla różnych próbek. Mogło to być wynikiem niezbyt dokładnej homogenizacji próbki. Ustalono eksperymentalnie, że próbka dająca silny sygnał dodatni może być rozcieńczona 100-krotnie i interpretacja wyniku dodatniego nie nastręcza trudności(...)
Test D (Commissariat a l'Energie Atomique – CEA – obecnie Biorad) wykorzystuje dwie techniki dla zapewnienia optymalnej czułości i specyficzności, a mianowicie specjalne przygotowanie próbki oraz dwustronny immunometryczny pomiar  rozpuszczalnego i opornego na trawienie proteazami białka PrP. Podpisana zostałaumowa z firmą Sanofi Pasteur na adaptację tego testu do produkcji handlowej. Celem tych działań jest także automatyzacja procesu przygotowywania próbek do badania i redukcja czasu immunometrycznego pomiaru wyniku, tak, aby czas wykonania testu zamknął się w 6 godzinach.
W podsumowaniu należy podkreślić, że chociaż oceniano cztery testy to tylko dwa (Prionics A.G. oraz Enfer Technology Ltd.) dostępne są w handlu. Pozostałe testy wymagają jeszcze szeregu adaptacji przed ich ostateczną komercjalizacją. Należy również podkreślić, że testy te, chociaż wysoce czułe i specyficzne, są testami pośmiertnymi. Brak informacji o korelacji pomiędzy progresją objawów klinicznych a koncentracją białka PrP opornego na trawienie proteinazami w okresie inkubacji choroby nie pozwala na wysuwanie jakichkolwiek wiążących wniosków odnośnie możliwości przyżyciowego laboratoryjnego diagnozowania gąbczastych encefalopatii.
Testy A oraz B należą do testów jakościowych dających albo wynik dodatni albo ujemny w przeciwieństwie do ilościowych testów C i D. Wyniki dla tych ostatnich wskazują, że wartości graniczne - progowe (z ang. cut-off points) opracowane przez obie firmy zbliżone są do wartości optymalnych. Jednakże w przypadku testów C i D kilka prób dało wyniki wątpliwe w zakresie wartości progowych. W przypadku testu C, 9 prób dało wyniki w zakresie 2,5-10 jednostek chemiluminescencji przy wartości progowej wynoszącej 5,5. Jednakże w każdym przypadku tylko jedno z dwóch powtórzeń dawało wynik wysoce dodatni (druga próba była ujemna). Dodatkowe badanie potwierdzające dało wynik ujemny dla wszystkich 9 prób a najwyższa uzyskana wartość jednostek chemiluminescencji wynosiła 1,2. Wartość progowa dla testu D wynosiła 0,25 jednostek absorbancji. Sześć prób dało wyniki w zakresie 0,2-0,25. Trzy spośród nich o najwyższych wartościach poddano badaniu dodatkowemu i uzyskano w każdym przypadku wynik ujemny. Stwierdzone wątpliwości w przypadku testów C i D wynikały z kontaminacji studzienek z próbkami ujemnymi materiałem pochodzącym z sąsiednich studzienek zawierających próbki dodatnie. W przypadku testu A, 46 prób dało wynik wątpliwy. Analiza przyczyn tego zjawiska wskazała na kłopoty z jednolitym odczytem kontroli ujemnej dającej wyniki w szerokim zakresie. Zmiana procedury przygotowawczej materiału do badania (większe rozdrobnienie prób) usunęła zaistniały problem”." – koniec cytatu.

Zasada Działania testu PRIONICS-CHECK:
Test Prionics-Check pozwala na wykrywanie białka PrP przy użyciu przeciwciał monoklonalnych. Jednakże przeciwciała te nie są w stanie różnicować normalnego białka PrP^C od białka patologicznego PrP^Sc. Służy temu etap trawienia homogenatów mózgowia proteinazą K, gdzie podatne na proteolizę białko PrP^C ulega rozkładowi i w próbce pozostaje jedynie białko patologiczne typowe dla zwierząt chorych na BSE - PrP^Sc. Elektroforeza białek w żelu (separacja w polu elektrycznym) a następnie immunodetekcja (reakcja enzymatyczna z udziałem substratu rozkładanego przez enzym - powodująca zaczernienie kliszy rtg) pozwala na wykrycie białka patologicznego, opornego na trawienie proteinazą K. Różnice w zakresie migracji (związane z różną masą cząsteczkową białek PrP^C oraz PrP^Sc ) stanowią dodatkowy element różnicujący białko normalne od patologicznego (jest to o tyle istotne, że niedotrawione fragmenty PrP^C dają sygnał dodatni - ale umiejscawiają się one w żelu powyżej sygnału dla białka PrP^Sc - które jako mniejsze migruje szybciej).

Wynik badania uważa się za dodatni gdy uzyskany  obraz białek spełnia trzy kryteria:
1) obecność PrP po trawieniu proteinazą;
2) niższa masa cząsteczkowa białka PrP (w stosunku do widocznej kontroli dodatniej nie trawionej proteinazą K);
3) obecność trzech prążków na żelu odpowiadających trzem glikoformom białka PrP.

Oceniając zalety testu Prionics-Check firma Prionics zwraca uwagę na następujące fakty:
- Czułość testu i jego specyficzność wynoszące 100%;
- Jednoznaczność wyników tj. nie stwierdzano wyników wątpliwych;
- Możliwość wykrycia zwierząt chorych na BSE w okresie inkubacji to jest w bezobjawowej fazie choroby, gdy    brak jest objawów neurologicznych;
- Krótki czas badania: 7-8 godzin (1-64 próbki)
                                     9 -10 godzin (96-192 próbki)
- Możliwość badania materiału złej jakości (autoliza)
- Automatyzacja badań - wg firmy Prionics dwie wyszkolone osoby mogą wykonać 250 badań dziennie (8 godzin).

Koszt badania w kierunku BSE testem Prionics-Check:
1. Badanie testem Prionics-Check materiału pobranego przez rzeźnię (wymagane przeszkolenie i posiadanie odpowiednich łyżeczek oraz pojemników na próbki) - 210 PLN
2. Badanie testem Prionics-Check wraz z pobraniem materiału i utylizacją głowy - 345 PLN.
 
 

Prosimy aby pismo przewodnie zawierało dodatkowe informacje ułatwiające nam wysyłanie wyników oraz wystawianie rachunków (dane adresowe), wzór (format "Word 97").
 
 

Łącza internetowe:
1. Strona firmy Prionics: www.prionics.ch
2. Raport Wstępny Komisji Europejskiej, 8 lipca 1999 r.; adres internetowy: http://europa.eu.int/comm/dg24/health/bse/bse12_en.html
 
 
 

Opracowanie Mirosław P. Polak
  Kontakt:
  tel./fax:  (081) 886 30 51 w. 213
  fax: (081) 886 25 95
  e-mail:  ppolak@piwet.pulawy.pl